Olas de calor y resistencias a virus

Olas de calor afectan resistencias a virus en horticolas

Leticia Ruiz, Dirk Janssen

Unidad de Virología, IFAPA La Mojonera

Ante los avisos de una nueva ola de calor sin precedentes, interesa recordar que periódicamente padecemos épocas de altas temperaturas. En 2015 se produjo una posible nueva enfermedad en pimiento de invernadero, que fue comentado en "Homo Agricola": https://elhocino-adra.blogspot.com/2015/08/schock-anafilactico-nuevo-patotipo-de.html . 

Tras estudiar este problema en el labo no solamente encontramos nuevas variantes de P1,2 de  virus del moteado suave del pimiento (pepper mild mottle virus, PMMoV) - que publicamos en la revista Journal of Plant Pathology DOI: 10.4454/JPP.V98I3.007, sino que propusimos la hipótesis de que las altas temperaturas - coincidiendo con el momento del problema, habían afectado a la resistencia a tobamovirus en dichos cultivares. 

Esta idea es importante en vista de la alarma que ha suscitado la posible presencia del nuevo virus tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), en nuestros cultivos y que ya ha invadido los cultivos de tomate en países como Jordania, Israel, Alemania, México, Italia y Turquía. Si durante esta oleada de calor se produjeran nuevos síntomas en cultivares de tomate que presentan la resistencia Tm2-2; deberían ser detenidamente estudiados para descartar que se trate de una rotura de resistencia frente tomato mosaic virus (ToMV).

A continuación reproducimos el artículo que publicamos en Agricultura 2000 a raíz de este estudio hecho en 2015. 

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Esto es el manuscrito para la publicacion en Agricultura2000, diciembre 2015

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EL VIRUS DEL MOTEADO SUAVE DE PIMIENTO (PMMoV):                            DUDAS, PREGUNTAS Y RESPUESTAS

Leticia Ruiz, Carmen García, Almudena Simón y Dirk Janssen

Unidad de Virología, IFAPA La Mojonera

            A final del verano de 2015 se observaron en algunos invernaderos de pimiento síntomas atribuibles a tobamovirus como son clorosis en hoja, necrosis en hoja, tallo y fruto, y muerte o colapso plantas. La gravedad de los daños ha hecho sospechar la presencia de una raza del virus capaz de infectar los cultivares resistentes a la que no existen cultivares resistentes. Sin embargo, resultados de estudios realizados en el IFAPA de La Mojonera sugieren que los patotipos encontrados son similares a aquellos ya existentes, y que las resistencias de los cultivares de pimiento se podrían haber resentido por condiciones climáticas adversas durante este año.

Pimiento y Tobamovirus

            El cultivo del pimiento es vulnerable al ataque de numerosos patógenos como  hongos, bacterias y virus; de todos ellos, los patógenos virales ocupan un importante papel por la merma que inducen, tanto en la cantidad como en la calidad del fruto. A nivel mundial se conocen alrededor de 50 especies de virus capaces de afectar al cultivo del pimiento.  En el área del sudeste español, el grupo de los tobamovirus es de especial relevancia tanto por su número como por las pérdidas económicas que ocasionan. Los virus de este género destacan por ser altamente contagiosos ya que se transmiten mecánicamente, a través de la semilla y pueden persistir durante largo tiempo en raíces en el suelo y herramientas contaminadas. De hecho, la transmisión por el suelo o por semilla se considera primera fuente de infección [3] en este grupo de  virus. Inicialmente, estos patógenos pueden causar síntomas foliares suaves que muchas veces pasan desapercibidos hasta que aparecen en los frutos, dando lugar a altas pérdidas en la producción. El nombre del género Tobamovirus es un acrónimo que procede del huésped y síntomas del primer virus descubierto en este grupo (Tobacco mosaic virus).

            En pimiento, la resistencia al género Tobamovirus está dirigida por cuatro genes, conocidos como L1, L2, L3 y L4 [1,2,6]. La resistencia que induce el gen L es sensible a la temperatura, esto quiere decir que a temperaturas altas el pimiento es vulnerable a las mismas enfermedades que el locus L previene,  perdiendo el carácter dominante del gen [8]. Atendiendo a los genes de resistencia que son capaces de superar en la planta, las distintas cepas o especies de Tobamovirus se han clasificado en cuatro grupos o patotipos: P0 (P0), P1 (P1), P1,2 (P2), P1,2,3 (P3) y P1,2,3,4 (P4). Virus con el patotipo P3 infectan sistémicamente plantas L1, L2y L3 y origina reacción de hipersensibilidad en plantas L4 [1,2]. Una infección sistémica se traduce en que el virus puede colonizar la planta, es decir, produce infección de otras células; sin embargo, una reacción de hipersensibilidad consiste en una reacción local que causa muerte de tejidos y no prospera la infección del virus en la planta (Imágenes 1, 2 y 3)

            Las cepas ordinarias de tobacco mosaic virus (TMV) y tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) puede ser patotipo P0 y P1. Las cepas de pepper mild mottle virus (PMMoV) pueden pertenecer a los patotipos P2, P3 y P4  y,  el conjunto de cepas y resistencias constituyen un sistema de patogeneidad creciente.

            Desde el inicio de la década de los 80 se conocían infecciones por TMV afectando a los cultivos de pimiento en invernaderos de Almería. En un estudio realizado ente 1984 y 2004 se encontraron P0 (18%), P1,2 (71%) y P1,2,3 (11%)  de PMMoV [8].            Desde finales de Agosto de 2015, y principalmente en la comarca del Campo de Dalías, se han observaron síntomas atribuibles a la presencia de tobamovirus en pimientos cultivados en invernadero, tales como clorosis en hoja y necrosis en hoja, tallo y fruto, hasta llegar incluso a la muerte o colapso de la planta (Imágenes 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Las variedades analizadas en el IFAPA de La Mojonera, procedentes de diferentes invernaderos del poniente almeriense, son resistentes al patotipo P2 de PMMoV_, aunque no al P3, quiere decir por tanto que son variedades L3. Además, existe una creciente preocupación en el campo por la posible presencia de la raza de P4 de PMMoV, no presente hasta el momento en Europa y  para la que no hay cultivares resistentes disponibles.

Etiología e identificación del patógeno

            Para determinar la etiología, es decir,  el origen de la enfermedad, las plantas se analizaron en el laboratorio por  inoculación mecánica en plantas indicadoras y por pruebas moleculares RT-PCR, RFLPs y secuenciación genómica.

            Inoculación mecánica

            Los pimientos afectados se inocularon en Nicotiana tabacum var. Xanthi, especie ampliamente utilizada como indicadora de la presencia de virus transmitidos mecánicamente y en una batería de cultivares de pimiento que presentan distintos grados de resistencia a PMMoV como se detalla en la Tabla 1.

  

CULTIVAR	EMPRESA	TIPO	RESISTENCIA	REACCIÓN
MAZO	UNIGENIA	CÓNICO		SISTÉMICA
MESSI	CAPGEN	ITALIANO	HR L3	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD
RODRI	VILMORÍN	ITALIANO	HR L3	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD
TUNDRA	ZERAIM	CALIFORNIA	HR L4	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD
REALTOS	ZERAIM	CALIFORNIA	HR L4	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD
ARISTEO	CLAUSSE	CALIFORNIA	HR L4	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD
UNICO	UNIGENIA	CALIFORNIA	HR L4	LOCAL, HIPERSENSIBILIDAD

Tabla 1. Cultivares de pimiento en los que se inoculó mecánicamente la planta infectada. HR L3: alta resistencia a los patotipos P0, P1 y P1 2. HR L4: alta resistencia a los patotipos P0, P1 y P1,2 y  P1,2,3

              El resultado de las inoculaciones se detalla en la Tabla 1 y las Imágenes 7 y 8. Todas los cultivares de pimiento inoculadas excepto el cultivar Mazo, junto con N. tabacum var. Xanthi,  dieron reacción local de hipersensibilidad. Este resultado indica, en el caso de los cultivares de pimiento, la presencia de un patotipo de PMMoV al que son resistentes los cultivares de pimiento portadores del gen L3 (cultivares Messi y Rodri)  y L4 (cultivares Tundra, Realtos, Aristeo y Unico). Asimismo, la presencia de reacción sistémica en el cultivar Mazo, sin resistencia a PMMoV, nos revela la posible presencia de este virus.

            Diagnóstico molecular: RT-PCR 

            A partir de extracciones de RNA de los pimientos infectados y, mediante la técnica de laboratorio, RT-PCR, se obtuvieron productos de DNA utilizando cebadores que amplifican el gen de la proteína de la cápsida del PMMoV [5].

               Como control de la reacción se usó un aislado P2 de PMMoV de la colección de aislados de IFAPA. Una vez amplificado el DNA, el producto de PCR fue secuenciado y su secuencia en aminoácidos (aas) se comparó con dos aislados P2 de PMMoV, uno de ellos descrito en España desde los años 90 (GenBank M81413), un aislado P3 y un P4.  El análisis muestra que la secuencia de aas de los pimientos estudiados PMMoV-ALM es exactamente igual que la de otros aislados caracterizados como P2 y diferente al aislado P3, descrito en nuestra zona también con anterioridad y al P4, aislado este último sólo descrito hasta el momento en Israel (Imagen 9)

            A partir del producto de PCR se realizó también un análisis RFLP. Esta prueba consiste en cortar el producto amplificado con una enzima de restricción que sabemos "a priori" que da un determinado patrón de corte. En este caso usamos la enzima MnlI que diferencia entre el nuevo patotipo P4 y los descritos con anterioridad en la provincia de Almería [5]. El resultado se muestra en la Imagen 10, donde se observa que todas las muestras exhiben el mismo patrón de corte e igual a nuestro control P2 por lo que confirmamos que no es PMMoV-P4. El análisis de su secuencia, nos confirmó además que se trataba de PMMoV patotipo P2.  

Temperaturas estivales.

El verano del 2015 ha sido excepcional por sus altas temperaturas y la duración de las mismas, lo que también afecta a los cultivos. La Figura 1 se ha hecho en base de los datos registrados en la Estación Meteorológica de La Mojonera (IFAPA), tomando las temperaturas medias de verano entre los años 2006 y 2015. La gráfica muestra cómo estas temperaturas han sido significativamente superiores en 2015 a las de años anteriores.

Figura 1.- Comparativa temperaturas estivales 2006 y 2015 (Estación meteorológica de IFAPA La Mojonera).

Conclusión

El uso de variedades hortícolas con resistencia a virus es una importante herramienta para el control de estos patógenos. Sin embargo, los virus sufren mutaciones al azar y están continuamente sometidos a presión de selección. Esto ocurre tanto para los virus descritos en nuestros cultivos como para los nuevos virus emergentes, independientemente del modo de transmisión. Tanto los datos biológicos (inoculación mecánica) como los moleculares confirman que el patotipo aislado a partir de pimientos con resistencia L3 a PMMoV, es el patotipo P2 de PMMoV, similar a otros aislados ya conocidos y presentes en los invernaderos de Almería hace años.

Todo parece indicar entonces, como es sabido, que la resistencia basada en el gen L se ha visto afectada debido a estas altas temperaturas, lo que podría favorecer la aparición de poblaciones del virus que tendrían más probabilidad de sobrepasar la resistencia basada en este gen. De momento parece ser que los problemas debido a tobamovirus en pimiento han bajado, pero no por ello debemos bajar la guardia.

Referencias

[1]. Boukema, I. W., Jensen, K., and Hofman, K. (1980). Strains of TMV and genes for resistance in Capsicums. In: Eucarpia Capsicum Working Group, Synopses of the IVth Meeting. Wageningen, The Netherlands. p 44-48.

[2]. Boukema, I. W. (1984). Resistance to TMV in Capsicum chacoense Hunz is governed by an allele of the L-Locus. Capsicum Newsletter, 3:47-48.

[3]. Greenleaf, W. H. (1986). Pepper Breeding. In: M. J. Bassett (Ed.). Breeding Vegetable Crop (pp. 67–134).

[4]. García Luque, I., Ferrero M. L., Rodríguez J. M., Alonso E., Cruz A. de la, Sanz A. I., Vaquero, C., Serra, M.T., Díaz Ruiz. (1993). The nucleotide sequence of the coat protein genes and 3' non-coding regions of two resistance-breaking tobamoviruses in pepper shows that they are different viruses. Archives of Virology, 131: 75-88.

[5]. Hamada H., Takeuchi S., Kiba Akinori, Tsuda S., Hikichi Y., Okuno T.  (2002). Amino acid changes in Pepper mild mottle virus coat protein that affect L 3 gene-mediated resistance in pepper. Journal of General Plant Pathology, 68: 155-162.

[6]. Sawada, H., Takeuchi, S., Hamada, H., Kiba, A., Matsumoto, M.,& Hikichi, Y. (2004). A new Tobamovirus-resistance gene, L1 of sweet pepper (Capsicum annuum L.). Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 73: 552–557.

[7]. Antignus Y., Lachman O., Pearlsman M., Maslenin L., and Rosner A. (2008). A new pathotype of Pepper mild mottle virus (PMMoV) overcomes the L4 resistance genotype of pepper cultivars.  Plant Disease, 92:  1033-1037 .

[8]. Fraile A., Pagán I., Anastasio G., Sáez E., García-Arenal F. (2011). Rapid genetic diversification and high fitness penalties associated with pathogenicity evolution in a plant virus. Molecular Biology and Evolution, 28: 1425-1437.